Prm1p, a Pheromone-regulated Multispanning Membrane Protein,Facilitates Plasma Membrane Fusion during Yeast Mating
细胞融合发生在从受精到器官形成的整个发育过程中。在这些过程中，驱动质膜融合的分子机制是未知的。尽管酵母交配提供了一个用来研究细胞融合的绝佳模型系统，但根据之前显示的所有调控该过程的基因都在细胞壁破裂时或之前起作用，换句话说，就是基因在两个质膜接触之前起作用。通过一种新的手段，使用基因组数据来预测哪些基因可能具有给定的功能，我们鉴定了PRM1，该基因在交配过程中选择性表达并编码多跨度跨膜蛋白。Prm1p定位于发生融合的细胞间接触部位。在Δprm1之间的交配突变体中，很大一部分细胞会启动合子形成并降解分离交配伴侣的细胞壁，但随后无法融合。电子显微镜分析显示，这些配对对中的两个质膜紧密并置，仅以约8 nm的均匀间隙保持分开。因此，Δprm1突变体的表现型定义了交配反应中的一个新步骤，在该步骤中，膜可能通过定义的粘附连接点并置，但保持非融合的状态。该表现型体现了Prm1p在质膜融合中的作用。
膜融合的核心问题是，如何使具有双分子层的疏水性脂质核心穿过一道水介质的间隔。通过研究病毒与宿主细胞融合以及运输囊泡与质膜和细胞器融合的研究，人们找到了答案。在这些系统中，融合蛋白或融合酶驱动反应。对于流感病毒，融合酶是血凝素蛋白（/血球凝集素）；对于囊泡，融合酶包括SNARE（可溶性*N-*乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合物（有关最新综述，请参见Hernandez等，1996；Jahn和Sudhof，1999）尽管血凝素和SNARE的成分不同——血凝素是一种能够直接插入宿主细胞质膜的病毒表面蛋白，而SNARE复合物由与不同双层相关的亚基组装而成——它们的最终结构具有显著的相似性（Weber等，1998）在每种情况下，组装的融合酶都将结构域插入每个成对 对置的双层中，并且在这些结构域之间有非常稳定的卷曲螺旋（Hughson 1995；Harbury 1998）根据目前的模型，形成这种盘绕线圈的能量非常有利，以至于它们将带负电的磷酸根基团聚集在一起并挤出其中的水，从而引发了双层聚变（Ramalho-Santos和de Lima 1998；Weber等人，1998）
尽管这种相对详细的机理模型很好地说明了病毒在分泌途径中的融合，但仍无法解释膜融合中的重要类别——细胞融合。细胞融合发生在受精过程中的精子与卵子间，也发生在诸如肌肉的合胞组织发育过程中，在这些[合胞组织][http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=d918cfc27af3c28b65704c13984ca3be&site=xueshu_se]中成肌细胞前体细胞往往融合成长管状并最终分化变成一条肌肉纤维,同时，在诸如巨噬细胞对于细胞或碎屑的细胞吞噬过程中，远远分开免疫细胞的质膜的区域必须融合以完成吞噬（Hernandez等人1996；Shemer和Podbilewicz 2000）。在每一种情况下，一对质膜双层都从细胞外融合。这些细胞是否因此表达一种更像病毒融合酶的拓扑结构的特殊SNARE？
如果是这样，则它还未被找到。到目前为止，鉴定出最接近的蛋白质是ADAMs，一种完整的膜蛋白，其包含一个类似于部分血凝素的肽，这个肽会插入宿主细胞的质膜中（Blobel等，1992；Bigler等，1997）在受精过程中，精子上的ADAM借助另一种卵膜蛋白CD9（Almeida等，1995；Chen等，1999）与卵上的α6β1整联蛋白结合阻断这种相互作用或去除CD9可抑制精卵融合（Chen等，1999；Le Naour等，2000；Miyado等，2000）由于已知该复合物中的蛋白质均不包含卷曲螺旋，因此这种结构如何产生使膜足够接近到完成融合所需的力仍然是一个谜。
为了鉴定介导细胞融合的新型蛋白，我们看向了酵母交配的模型系统，其中两个单倍体细胞融合以产生二倍体。配对反应简要地说，如下进行：单倍体形式存在两种交配型，a型或α型，交配型分泌信息素（分别对应a因子和α因子）信息素可以被另一种交配型的检测到。当信息素浓度达到一定水平时，交配反应开始进行。交配的第一步包括细胞周期停滞，细胞壁重塑以及交配伴侣彼此极化。当配对对象接触时，细胞壁会紧密在一起以形成一个连续的外层。在这时，配对伴侣牢固地附着在一起，但每一个仍被细胞壁完全包围，质膜尚未接触，细胞当然尚未融合。据说此阶段的细胞已形成“配对”或“前合子”。要完成合子的形成，分隔伴侣的细胞壁必须降解，质膜必须接触并融合。最终，单倍体原子核必须合为一个二倍体原子核。
通过寻找可以形成交配对而不是二倍体的细胞，许多遗传筛选已经鉴定出在这些步骤中有缺陷的突变体。然而，所有突变体都在细胞壁破裂或核融合的步骤中停留在交配反应中（综述于Berlin等，1991；Marsh和Rose，1997）尽管这些类型的基因已经提供了有关细胞极化，细胞壁重组，渗透稳定性控制以及细胞器定位和动力学的见解，但是寻找介导在质膜正确并置之后发生的真正脂质双层融合步骤的基因仍然很难。我们已经利用了最近积累的大量基因表达数据来寻找可能控制质膜融合的蛋白质。
程序是用脚本语言Perl编写的。Webminer（ps：网络数据采集分析器）的源代码和所用数据库格式的描述可从http://webminer.ucsf.edu获得。通过在斯坦福大学DNA测序中心（http://www-sequence.stanford.edu/group/candida）和桑格中心（http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe）上进行BLAST搜索未完成的基因组测序项目，确定了*PRM1*的同系物——*白色念珠菌*和*粟酒裂殖酵母*。多序列比对是用MultAlin完成（Corpet 1988； http://protein.toulouse.inra.fr/multalin.html）。跨膜结构域预测是使用SOSUI程序完成（Hirokawa等，1998；http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html）然后通过丢弃所有同源物中不存在的推定的跨膜片段完成精制优化。如Singh等人所述，使用LearnCoil-VMF进行卷曲螺旋预测。1999（http://nightingale.lcs.mit.edu/cgi-bin/vmf）。
该研究中使用的菌株见Table 1。基因置换，表位标记的构建体和绿色荧光蛋白（GFP）融合是通过PCR转化技术生成的（Longtine等，1998年）：使用独特的引物和一套标准的模板质粒进行PCR，以生成由一对靶向PRM1的整合DNA序列，位于通用盒旁。该盒包含三个拷贝的血凝素（HA）-表位标签，GFP的编码序列，或者两者都不包含，以及一个可选择标记。野生型二倍体的转化导致该构建体的插入，它的插入取代了整个PRM1编码序列，或（对于基因标记）在其3'端插入框架，以替换天然终止密码子。选择后，通过PCR分析二倍体以正确插入构建体，然后形成孢子以回收携带整合的DNA的两种交配类型的单倍体。如前所述，质粒pDN291用于表达可溶性胞质GFP（Ng和Walter 1996）质粒pRS314和pRS316是分别包含TRP1和URA3基因的标准载体，在这里用于创建一组交配类型特异性选择标记（Sikorski和Hieter 1989）。
种类 基因型
所有种类都在W303环境下构建
为了检测Prm1p-HA的表达，在0.5 UA 600的光密度下，以指数方式生长5 ml培养物用10μl含5mg / mlα因子（Sigma-Aldrich）的DMSO溶液处理，或与等体积相反交配类型的细胞混合，也来自指数生长的培养物。当混合两种交配类型的细胞时，当两种培养物在对数相中从极低的密度连续生长过夜时，可以看到最大的基因诱导（寄主和病原物基因在相互作用下受活化或增强表达的现象），这可能是由于信息素在培养基中的积累。实际上，仅这些培养物的条件培养基具有可检测的诱导活性（隐性的）。在混合后的相关时间点，将培养物在4℃下短暂旋转，并吸出上层清液。将细胞沉淀重悬于50μlSDS-PAGE样品缓冲液中，添加到少量玻璃珠中，并通过在温度4°C下连续涡旋90s裂解。整个过程耗时小于4分钟。将裂解物煮沸10分钟，然后旋转以除去不溶性碎片。
或者，使用糖苷内切酶H处理的方法，一样按照之前的方法裂解细胞，除了样品缓冲液由制造商（New England Biolabs，Inc.）提供的45μl变性缓冲液代替。然后将样品煮沸10分钟，与所提供的5μlG5缓冲液和1μl酶混合，在37°C下培养90分钟，并在上样之前在SDS-PAGE样品缓冲液中以1:10稀释。
如使用蛋白质印迹分析方法，将裂解物在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用标准规程转移至硝酸纤维素膜上。用1:1000稀释的小鼠单克隆抗HA一抗（HA.11; Covance）染色细胞膜，并用1:2000稀释的偶联了的辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠二抗（Bio-Rad Laboratories）印迹，并使用增强版化学发光工具包(Renaissance kit; NEN Life Science Products)
为了可视化信息素处理的单倍体中Prm1p-GFP的位置，使细胞在含有两倍标准浓度腺嘌呤的确定培养基中生长至对数期，以防止腺嘌呤生物合成的自体荧光副产物积累。然后将培养物暴露于10μg/ mlα因子。加入信息素后第40、70和100分钟取样，放置在载玻片上，并在共聚焦显微镜（Leica）上成像。另外，要检查Prm1p-GFP在受精卵中的定位，可以携带各自带有PRM1-GFP的相反交配类型的细胞融合体生长至对数期，等量混合，点在酵母提取物/蛋白pe /葡萄糖（YPD）板上，并在30°C孵育2小时。然后将细胞从板上重悬，点在载玻片上并成像。由于Prm1p-GFP信号微弱，因此首先对四个高强度激光扫描取平均值，从而取走了大部分荧光，从而拍摄了一个内侧光学切片。然后，收集八个光学部分的堆栈以记录细胞中剩余的荧光。然后，使用OpenLab软件（Improvision）使用此信息对高强度部分进行反卷积。使用此软件还可以平滑图像并增强对比度。
将具有表达可溶性胞质GFP的α菌株的相反交配类型的细胞生长至对数期，混合并抽真空至硝酸纤维素滤膜。将滤器细胞侧朝上放在YPD板上，并将板在30°C下孵育3小时。然后将细胞从过滤器上刮下来，固定在4％多聚甲醛中，并在4°C孵育过夜。然后将该混合物点在载玻片上，并用共聚焦显微镜（Leica）观察。首先，使用透射光学器件随机选择一个场。然后，通过明场显微镜鉴定该场内的合子和交配对的组，随后通过在明场和荧光之间切换来将其计为融合的合子或未融合的交配对。继续进行此过程，直到对现场的所有受精卵和交配对进行评分，这时选择了一个新字段，然后再次开始该过程。为了捕获图像，通过明场和荧光显微镜拍摄了单个光学部分。然后将这些图像叠加并增强对比度。
对于交配反应，将相等数量的相反交配类型的Δprm1细胞混合，离心，点样在YPD板上，并在30°C交配3 h。刮下细胞，并在EM固定液（1％戊二醛，0.2％多聚甲醛，0.04M KPO 4，pH 7）中固定5分钟，旋转，并在EM固定液中在冰上孵育50分钟。然后将细胞用0.9％NaCl洗涤两次，用水洗涤一次，并用2％KMnO 4（Mallinckrodt）洗涤一次。接下来将细胞在2％KMnO 4中孵育在室温下放置45分钟。然后将它们通过分级乙醇脱水（用50％，70％，80％，90％，95％和100％乙醇洗涤10分钟），并在100％乙醇的最终洗涤液中储存过夜。为了准备包埋，将细胞用环氧丙烷洗涤五次，每次10分钟。为了嵌入，将细胞逐步穿过梯度浓度的树脂（32％Epon，18％Araldite，34％DDSA，16％NMA； Ted Pella Inc.）与环氧丙烷混合，方法如下：每个2小时与1：2树脂混合混合：1：1环氧丙烷，1：1、2：1和3：1的混合物，然后用纯树脂洗涤1小时，然后用纯树脂渗透过夜。第二天，将细胞转移至含有约2％BDMA的树脂（Ted Pella Inc.）中，孵育4小时，最后放入含有2％BDMA的新鲜树脂中，沉淀，然后在60°C下孵育几天以用于树脂变硬。
我们设计了一种策略，以鉴定可能由于交配伙伴内部或之间的功能冗余而逃避了早期遗传筛选的特定交配基因。这种冗余通常会产生难以检测的弱表型。例如，在冗余的基因的情况下FUS1和FUS2，一个fus2突变体显示小配合缺陷，除非两个交配伴侣也有不足之处中FUS1（真心的马背等，1987）。为了避免在我们的搜索中忽略功能冗余的基因，我们采用了反向遗传策略，该策略最初不依赖于突变表型的强度。具体来说，我们问：“尚未研究哪些信息素诱导的膜蛋白？”
为了解决这个问题，我们编译了已经发表的基因表达数据和基因特性数据库，以一种通用格式对其进行了重组，并编写了一个程序来搜索该复合数据库。我们使用称为Webminer的程序（请参阅材料和方法），通过用信息素α因子处理，检查了G1中停滞的细胞的基因表达谱。这些基因组表达数据集最初是在另一小组对细胞周期转录的研究过程中收集的，并可以在线获得（Spellman等，1998）。; http：//基因组-www.stanford.edu/cellcycle）。我们重新解释了数据，以鉴定大量强烈信息素诱导的蛋白质。作为第二个标准，我们要求潜在的靶蛋白具有至少一个疏水域，指示分泌或膜蛋白。
具体而言，我们设置了一个任意的临界值，以选择通过交配信息素诱导三倍以上的基因。该标准从基因组表达数据集中检测到的6,116个ORF中识别出54个候选开放阅读框（ORF）（图1）。接下来，我们为每个ORF分配一个分数，以反映其编码膜蛋白的可能性。为了计算这些值，我们编写了一个程序，该程序在19个氨基酸残基的窗口中扫描预测的蛋白质序列，并根据其氨基酸组成为每个窗口分配疏水性或H值。我们使用的疏水性值是基于经验观察到的已知氨基酸在已知跨膜结构域中的存在频率（Boyd等，1998）。）。所有蛋白质窗口中最高的H值已定义为该蛋白质的MaxH（Boyd等，1998）。在大多数生物中，所有蛋白质的MaxH值都呈双峰分布，波谷为28.5（Boyd等，1998）。较低的值表示一组胞质蛋白（例如Tub1p，α微管蛋白，具有22.5的MaxH），较高的值表示膜蛋白（例如，Hxt1p，己糖转运蛋白，具有30.9的MaxH）。在酿酒酵母中虽然存在MaxH值的双峰分布，但是两组之间的重叠是相当大的。结果，许多已知的膜蛋白的MaxH值＜28.5。因此，通过将所有MaxH值> 25的ORF视为可能的膜蛋白，我们设置了一个不太严格的阈值，从而产生了2,524个ORF。该参数将我们的54个候选基因范围缩小到20个基因，此后我们将其称为PRM基因（信息素调节的膜蛋白）。
在这20个基因中，有10个具有先前分配的功能（图1）。有趣的是，可以根据它们在交配中的作用合理地鉴定所有10个基因：四个基因参与细胞融合（包括原型融合基因FUS1和FUS2；Trueheart 等人，1987年）（图1，蓝色）。 ，三个基因参与细胞壁的合成和重塑（包括编码交配凝集素的AGA1和AGA2；Cappellaro等人，1991）（橙色），三个基因参与与交配相关的其他功能（包括编码STE2的STE2）在一个特异性信息素受体；詹尼斯等。1983年）（绿色）。
其余10个ORF尚未进行研究（表；图1，红色）。基于成功鉴定了参与交配的其他膜蛋白，它们很有可能在此过程中也发挥作用。我们在这里描述了诱导程度最高的ORF YNL279w的表征，我们将其称为PRM1。
预测的酿酒酵母 Prm1p在其他真菌中具有明显可识别的同源物，例如白色念珠菌（Contig 5-2425，位置7551-5680），粟酒裂殖酵母（GenBank / EMBL / DDBJ No. 7630122）和乳酸克鲁维酵母（GenBank） / EMBL / DDBJ No.AJ229977； Ozier -Kalogeropoulos等，1998）（图 2A ），但是不包含暗示其功能的可识别基序。
Prm1p具有五个保守区，基于它们的疏水特性，它们很可能跨越整个膜（图 2A ，上划线）。这些推定的跨膜结构域会将蛋白质分成膜的一侧的〜175个残基的两个片段，以及膜的另一侧的两个50-100个氨基酸的片段（图2 B）。在一起，两个较大的部分都具有14个潜在的*N-*糖基化位点（图2a和图b，方框和Y符号），而较小的则没有。大片段在三个同源物中显示出最大的序列相似性，其中约三分之二的残基保守。有趣的是，LearnCoil-VMF将这些片段识别为潜在的卷曲螺旋形成区域，该程序旨在识别病毒性镰刀菌（Singh等，1999）。但是，卷曲螺旋结构不太可能在跨膜片段锚定在两侧的蛋白质区域内组装。因此，Prm1p的预测总体图为多跨膜完整膜蛋白的图，该膜蛋白在膜的一侧呈现出一个较大的，进化上保守的面，而在另一侧则呈现出一个较小的，较不保守的面（图2 B）。
为了表征Prm1p，我们构建了携带融合基因的菌株，该融合基因将HA表位标签附加到蛋白的COOH末端（Prm1p-HA）。然后，我们通过用SDS-PAGE解析总细胞裂解物并通过免疫印迹观察Prm1p-HA，分析了在交配或对照条件下细胞的Prm1p-HA表达。
营养生长的细胞不以可检测的水平表达Prm1p-HA（图3A，泳道1），但在添加α因子（泳道2）后5分钟内开始表达。信息素处理20分钟后，Prm1p水平达到最大值并持续稳定（第5-7泳道）。
Western印迹分析确定Prm1p-HA（以及扩展名为Prm1p）为几种主要形式：以73 kD迁移的一条清晰的条带，从PRM1-HA开放阅读框预测的大小（图3A，箭头）以及一系列宽频带的中心大约为115 kD（括号）。在用糖苷内切酶H处理后，这些物种折叠成约73 kD的单条带，表明较大的条带被异源糖基化（图3 A，第9道）。大量添加低聚糖的存在证实了我们的预测，即Prm1p最初整合到内质网的膜中，并且基于图2中提出的拓扑结构 B，表明Prm1p可能在膜的腔或细胞外侧显示其两个大的保守节段。
除了新合成和糖基化形式外，我们还可再现地观察到在〜15 kD处迁移的弱条带，该条带在信息素处理30分钟后出现（图3 A，第7道，*）。根据HA表位的位置，该条带可能代表一个COOH末端片段，表明Prm1p-HA在其成熟过程中可能会经历蛋白水解过程。
当用相反交配类型的伴侣攻击时，两种交配类型的细胞都会诱导Prm1p。当与未标记的α细胞混合30分钟时，交配类型a的细胞表达Prm1p-HA，但与相同交配类型的细胞混合时则不表达（图3A，泳道11和12）。反之亦然（图3 A，第13和14道）：当与未标记的a细胞混合时，α细胞表达Prm1p-HA ，而与未标记的α细胞混合时则不表达Prm1p-HA 。Prm1p-HA诱导α细胞比在弱一个细胞，可能是由于亲脂性的减少的扩散一个与更亲水的α因子相比因子。
交配过程中Prm1p表达的速度和程度可能是由于基因编码序列上游存在信息素反应元件（PRE）所致，正如许多其他交配特异性基因一样。的启动子PRM1包含三个头-尾重复紧密匹配的共识PRE，TGTTTCA 一吨（图3 B）（元和1991的字段）。重复序列被三核苷酸间隔区TAC分开。这些序列在PRM1编码序列的上游出现150-180个核苷酸，并可能作为转录因子Ste12p的结合位点，后者是MAP激酶级联的靶标，将基因表达与细胞外信息素的存在联系起来（Herskowitz 1995））。
作为阐明Prm1p功能的第一步，我们询问蛋白质在哪个细胞区室中驻留。为此，我们构建了带有由其自身启动子驱动的PRM1-GFP融合基因的染色体拷贝的菌株，这使我们能够通过荧光显微镜检测Prm1p-GFP基因产物。
在信息素处理40分钟后，Prm1p-GFP首先以两个环可见，一个环包围细胞核，一个环位于细胞周围（图4 A）。这种染色模式是酵母内质网的典型特征，与进入分泌途径的Prm1p一致。
加入α因子后70分钟，大多数细胞已停滞在细胞周期的G1期，这是由其巨大的未预算状态所证实，并已开始极化。Prm1p除了持续染色内质网外，还积累在由这种极化形成的“大腹”中（图4 B）。
通过信息素处理100分钟，大多数细胞已形成交配突起或shmoos。这些shmoos将在更生理的环境中朝向最大的信息素浓度定向，并成为交配对象首次接触的场所。Prm1p定位于shmoo的尖端，在此处会发生细胞融合（图4 C）。
接下来，我们混合a和α细胞，它们都带有PRM1-GFP融合基因。在这种生理交配混合物中，Prm1p-GFP位于最近形成的交配对或受精卵的中点，两个细胞相遇并启动了降解中间细胞壁并融合其质膜所需的步骤（图4 D）。在已经完成该融合步骤的配对中，Prm1p-GFP在合子的颈部周围形成了一个项圈（图4 E）。
当生成的二倍体开始萌芽时，Prm1p-GFP定位于正在生长的子代（图4 F）。由于二倍体不再表达Prm1p（数据未显示），因此染色第一个女儿的蛋白质可能是从亲代细胞继承的。
为了测试Prm1p在交配过程中是否参与细胞融合（如其表达谱和定位所示），我们构建了其中PRM1通过基因置换而缺失的菌株（请参见材料和方法）。当两个交配伙伴都缺乏PRM1时，我们通过相差显微镜观察了形态异常的交配对。最常见的像差是在交配对颈处存在明显的暗带，反映出交配伴侣之间未降解的细胞壁提示细胞融合缺陷。
为了更果断地监测该表型，我们构建了Δprm1α菌株，该菌株表达了可溶的胞质形式的GFP，可标记其细胞质。该菌株使我们能够通过评估GFP是否已扩散到两个细胞（表明细胞融合成功）或仍然局限于一个交配伴侣（表明融合失败），来容易地将融合的受精卵与未融合的交配对区分开。使用该测定法，我们清楚地观察到Δprm1伴侣之间的交配产生了融合的受精卵和未融合的交配对的混合物（图5A和图B）。
接下来，我们使用表达GFP的野生型和Δprm1α菌株对Δprm1融合缺陷的程度进行了定量。为此，我们将每种菌株的指数生长培养物与合适的伴侣菌株混合，将它们浓缩在滤膜上，然后将滤膜放在YPD平板上，让细胞交配3 h。然后，我们将培养物固定在显微镜下。此时，由野生型对照细胞产生的合子已经丰富，但大多数仍是新鲜形成的，刚开始生长它们的第一个二倍体芽。
在野生型对照菌株之间的这种交配混合物中，6％的受精卵/交配对记为未融合（图5C）。据推测，该基线水平反映了交配反应中的动力学中间产物，如果允许反应继续进行，这些细胞最终将融合。这些未融合的交配特征是脖子很窄。相反，当两个交配对象都缺乏PRM1时，受精卵/交配对中55％未融合，与野生型菌株相比，数量增加了9倍（图5）。C）。这些交配对可能反映了融合反应的动力学延迟，或者可能代表了一个死胡同，在该交配中某些步骤已经出错并且无法发生融合。在稍后的时间点，融合的受精卵与未融合的配对之间的比率没有明显变化（数据未显示），这与动力学延迟的预测相反。此外，在许多来自Δprm1 × Δprm1交配的交配对中，颈部直径显着增加，表明这些未融合的交配对与野生型对照反应中低频观察到的在质量上存在差异。
双方都需要Prm1p来促进有效的细胞融合吗？当一个交配对象缺少PRM1而另一个是野生型时，我们始终观察到轻微但明显的融合缺陷，所有交配对中有12％未能融合（图5 C）。无论哪个伴侣携带野生型PRM1等位基因，该缺陷都是相似的。这些结果表明，Prm1p即使在一个配偶伙伴中均存在，但对称地起作用，并且即使其效率不断降低，也可以履行其职责。
除了图4 B 中所示的所有融合突变体典型的简单未融合表型外，我们还观察到了Δprm1 × Δprm1交配中更不寻常的形态。值得注意的是，一些交配对显示出细胞间的气泡，来自一个交配伴侣的GFP标记或未标记的细胞质囊，似乎已经侵入了另一个（图6，AG）。这些气泡在两个方向上的出现频率均相等：“ innies”侵入α伴侣（图6A和图B），“ outies”从α细胞延伸到a细胞（图6）。，CG）。气泡的大小和形状各不相同，范围从原本直的细胞间的微小凸起到大的圆形囊袋，或很少有蜿蜒延伸的蛇形延伸物，延伸到另一个交配对象的整个长度。
另外，我们观察到一个或两个交配伙伴已经萌芽了一个新的子细胞（图6D，图G和图H）。萌芽表明细胞已经从暴露于交配信息素诱导的G1停滞中逃脱，并重新进入了细胞周期，从而使其进入了新的分裂周期。显然，即使被分泌信息素的相反交配类型的细胞所包围，并且实际上甚至粘附在其中之一上，也可能发生这种信息素释放的释放。
最后，一些细胞似乎放弃了失败的交配，而不是发芽，开始与附近的另一个伴侣交配。例如，在图 6H中，右下方的表达GFP的细胞似乎试图与左侧的伴侣交配而失败。然后，它继续尝试右侧的单元格，而其原始的交配伙伴退出了交配逮捕区并开始萌芽。
这些细胞离开G1或向新伴侣极化并重新开始交配的能力表明，Δprm1突变体不会比野生型更简单地融合。相反，他们放弃融合尝试的事实表明他们已经走到了尽头，即使给予更多的时间也不会形成正常的二倍体合子。
气泡表明在交配伴侣之间细胞壁被破坏，这种表型不同于其他融合突变体。我们使用薄层电子显微镜更紧密地检查了Δprm1缺陷的这一方面。
许多交配对在交配伴侣之间的界面中心处表现出明显的细胞壁溶解（图7，A–D）。在大多数情况下，我们发现有必要检查通过单个配对对的连续切片，以找到发生突破的点。细胞壁降解的区域几乎总是包括细胞-细胞界面的中心。在某些情况下，它似乎局限于中心（图7B和图D），而在其他情况下，它似乎不对称地扩展到配对对的一个边缘（A和C）。
野生型交配涉及在该界面中心对细胞壁进行类似的局部破坏，然后进行质膜融合和持续的细胞壁重塑，直到细胞之间的细胞质桥跨过合子的整个宽度并且细胞壁受到限制到外围（Gammie et al。1998）。细胞壁破裂后但膜融合之前的中间体的详细信息尚不清楚，因为它们尚未被电子显微镜捕获，大概是因为这些步骤会迅速发生。
Δ PRM1细胞似乎成功地完成初始细胞壁击穿但此后未能进行质膜融合和续细胞壁重塑。在Δprm1交配处去除细胞壁的位置，两个质膜紧密并置（图7）。似乎两个伙伴均将附加膜均等地添加到该区域，从而产生可能对应于荧光显微镜观察到的气泡的凸起。因此，一个交配对象的体积一定已经增加，而另一对象的体积却缩小了相同的数量。同时，它们的表面积必须协调增加。
直径约20 nm的囊泡通常存在于凸起中，通常排列成沿交配对的长轴定向的单排行（图7 A），表明细胞骨架附着。这些囊泡被密集染色的材料包裹着，类似于两个交配对象之间插入的材料。这些囊泡可能会递送新的膜，导致凸起的生长。
有趣的是，凸起的并置的质膜是等距的，沿它们的整个长度始终保持约8 nm的间隔（图7）。在它们之间发现了一层薄薄的密集染色材料，让人联想到哺乳动物细胞之间发现的膜粘附连接。
我们确定了一种新蛋白，具有预期在交配过程中参与细胞融合的因素的几个特征。首先，Prm1p仅在响应信息素时才由两种交配类型的细胞表达。其次，它定位在smooing细胞中交配突起的尖端以及交配对和受精卵的颈部。第三，在其明显的拓扑结构中，它将向交配伴侣的质膜呈现两个大区域，这两个区域在广泛散布的真菌之间是保守的。最后，删除PRM1会导致细胞融合的重大缺陷，与野生型交配相比，未融合交配对的数量增加了九倍。因此，在某些方面，PRM1类似于已经描述的许多基因。但是，在一个关键方面，它与迄今为止发现的基因有很大的不同。Δprm1交配产生的未融合合子不会像其他融合突变体那样被完整的细胞壁捕获（Kurihara等，1994；Elia和Marsh，1996；Elia和Marsh，1998；Gammie等，1998；Santos等，1997）。；Erdman等人，1998）。相反，Δprm1突变体成功降解细胞壁，并使交配伴侣的质膜紧密靠近。然而，膜仍未融合。交配反应中的该中间体之前尚未被捕获，并在该途径中定义了新的步骤。在膜融合的上游，细胞壁破裂的下游，Prm1p处于独特的位置，可以帮助我们了解双层的结合方式以及推动其融合的因素。
目前，我们没有足够的信息来区分Prm1p如何促进膜融合的各种模型。原则上，Prm1p可以作为新的融合酶直接在融合步骤中起作用，或在融合上游的步骤中间接起作用。
在Δ的最简单的解释PRM1的表型是Prm1p直接参与聚变反应。然而，该模型必须与两个观察结果相吻合。首先，缺少融合酶的突变体将表现出绝对的交配缺陷。相反，几乎所有Δprm1 × Δprm1交配对中的一半仍然成功融合，并且使用基于板的经典交配测定（一次测量数千个细胞中二倍体形成），Δprm1交配缺陷似乎可以忽略不计（数据未显示）。因此，如果Prm1p在膜融合中起直接作用，则必须存在替代的融合机器（或包含Prm1p的复合物中的其他亚基），并且在去除Prm1p时会低效地接管。第二，建议的Prm1p跨膜拓扑结构不容易符合为病毒或含SNARE的富丝酶开发的范例。特别是，全长Prm1p不提供任何细胞外自由端，可以很容易地想到它们充当经典的融合肽或参与螺旋卷曲相互作用。因此，更深入地定义Prm1p的生物化学将很重要：Prm1p是否与其他亚基相关？当在细胞表面表达时是否经过蛋白水解处理（如初步观察到的COOH末端片段提示图3A）？蛋白水解加工可以产生具有不同拓扑结构的蛋白质片段，并且根据现有模型，该片段更具吸引力。当然，Prm1p在膜融合中直接作用的最终证据只能来自生物化学证明，Prm1p，可能带有相关的亚基，足以进行脂质双层融合。
另一种观念是，Prm1p在信号或结构能力上在融合事件的上游起作用。例如，Prm1p可能在感知交配伙伴接近并通过激活融合机制做出反应的途径中发挥作用。对信息素产生弱缺陷的突变体进行的实验表明存在这种途径（Brizzio等，1996；Elia和Marsh，1996）。确实，这些突变体之一被发现产生类似于Δprm1气泡的结构，尽管频率较低（参见Elia和Marsh，1996年，图3 D ）。另一种可能性是Δprm1缺陷可能是结构性问题，而不是发信号。分离质膜的浓污物质可能代表细胞壁碎片，Δprm1突变体无法清除。但是，由于气泡生长时，任何残留的细胞壁碎片都必须弯曲且变薄，因此大气泡的膜应比小气泡的膜靠近。实际上，这是不正确的：无论气泡的大小如何，整个膜界面的间隙始终约8 nm。该观察结果表明，该间隙不是被不可降解的细胞壁碎片所占据，而是被气泡增长时均匀沉积的特定结构元素所占据，可能是粘附复合物固定了处于预融合状态的膜。没有Prm1p，粘附复合物可能仍会组装，但功能不佳。因此，膜会粘在一起但不会融合。
我们在这里介绍一种新型基因搜寻的结果，随着基因数据库的发展，这种搜寻可能会越来越普遍。以前，酵母交配过程中的膜融合问题已被证明对遗传学方法是难治的。尽管受到了来自多个方向的攻击，并鉴定了在合子形成过程中起作用的许多有趣基因，但PRM1是第一个在膜融合水平上明显起作用的基因。为什么在此步骤中很难找到突变体？
大多数成功的筛选都已经认识到并以某种方式规避了交配遗传学的主要挑战。具体而言，为了在二倍体形成中实现明显的缺陷，通常有必要不仅在一个细胞中而且在两个交配伙伴中都损害通路。三种策略解决了这个问题。首先，一些小组面临着巨大的挑战，即进行随机诱变的方式是在两种交配类型中都产生带有互补选择标记的突变（Berlin等，1991；Kurihara等，1994）。）。这种方法可以直接测定任何与自身杂交的突变体的交配效率。这种策略的优点是不会偏向某个特定的途径-实际上，不仅发现了控制细胞融合而且控制核融合的基因-但也许由于其复杂性，它的背景是假阳性突变体，不鼓励采用这种饱和方法。
第二种方法是利用已知融合途径中预先存在的缺陷，例如fus1 fus2突变体（这两个基因都是在现有实验室菌株中偶然发现的），并要求新突变体与弱势菌株交配，但与野生菌株交配不佳。型菌株（Berlin等，1991；Chenevert等，1994）。该策略的优点是易于设置和执行，尽管它可能偏向于起始突变的途径，并且可能无法有效地找到新途径的组成部分。
最后，已鉴定出信息素调节的基因，然后分析这些基因中的突变体的交配缺陷。该方法最初是使用随机整合的报告基因构建体进行的（Erdman等，1998）。我们在这里使用已有的基因组数据集和计算机辅助搜索的疏水蛋白相结合，扩展并简化了后一种方法。这项技术使我们无需进行传统筛选即可开始检查候选基因破坏。Webminer软件使该方法易于适应于许多研究，这些研究寻求在某些条件下表达的蛋白质，而不在其他条件下表达的蛋白质，并且包含特定的结构特征。
Prm1p在细胞融合中的作用的鉴定强调了这种计算机辅助方法的敏感性。尽管Δprm1交配缺陷的渗透率可能处于传统筛选无法检测到的极限，但通过鉴定一小组候选基因并检查单个交配对（两个配偶都携带相关突变），我们可以看到一种独特的表型提供了一个机会来检查分子细节上的双层缔合和融合机制。